母親、胎児、新生児のマイクロバイオームの包括的な特性評価により、出生前における消化管の定着をサポートします

Scientific Reports volume 13、記事番号: 4652 (2023) この記事を引用

818 アクセス

4 オルトメトリック

メトリクスの詳細

この研究では、妊婦とその新生児から採取したさまざまなサンプルのマイクロバイオームを包括的に特徴付け、母親と新生児のペア、サンプル採取場所、および産科的要因の間の類似点と関連性を調査することを目的としました。妊婦の膣分泌物と羊水、新生児の臍帯血、胃液、胎便からサンプルを収集しました。私たちは、141 人の妊婦と 178 人の新生児の 641 サンプルから 19,597,239 個の細菌配列を特定しました。汚染物質を除去するために厳格なフィルタリング基準を適用することにより、従来無菌と考えられていた子宮内環境および胎児の胃腸管において微生物の定着の証拠を発見しました。マイクロバイオームの分布は、母親と新生児のペアではなく、サンプル収集場所によって強くグループ化されました。新生児が最初に排泄する便である胎便の独特な細菌組成は、正常な妊娠中に微生物の定着が起こることを裏付けています。胎児は子宮内で羊水を飲み込み、正常な生理学的条件下では尿が羊水に戻ることから、予想通り、新生児の胃液中のマイクロバイオームは母体の羊水中のマイクロバイオームと類似していましたが、同一ではありませんでした。妊娠中にのみ形成されるさまざまなサンプルからマイクロバイオームライブラリを確立することは、人間の発達を理解し、産科合併症におけるマイクロバイオームの変化を特定するために重要です。

ヒトのマイクロバイオームには、人体の多くの秘密に対する答えが隠されている可能性があります。それは健康の恒常性の維持に関係しており、多くの病気に関連しています1,2。最近の研究は、人類の発達におけるマイクロバイオームの役割をより深く理解するために、乳児や妊婦など、あまり研究されていない集団におけるマイクロバイオームを調査することに移行しています。マイクロバイオームの発生は子宮内環境から始まり、生涯にわたって変化し、免疫系と代謝に継続的に影響を与える可能性があります。妊娠は母体内の微生物数を変化させることが示されており、将来の母体、胎児、新生児の健康に影響を与える可能性があります3。妊娠により、異物に対する一時的な免疫寛容が可能になり、マイクロバイオームのリモデリングが促進され、免疫系と代謝への潜在的な適応が促進されます4。妊娠中のいくつかのマイクロバイオーム研究では、伝統的に無菌として知られている胎盤や羊水を含む胎児環境には、日常的に行われる培養技術では同定されないいくつかの特徴的なマイクロバイオームが含まれていることが提案されています5,6。しかし、これらの微生物叢のバイオマスは小さく、配列決定方法の信頼性と汚染の可能性が批判されています。これらの微生物叢と特定の産科症状との関連性はまだ証明されておらず、さらなる調査が必要です。

膣は子宮頸部を通って子宮に接続されており、皮膚に露出しているため、女性の生殖器内で細菌が存在することが最もよく研究されている場所です。しかし、妊娠中のマイクロバイオーム研究は、倫理的な懸念とサンプルへのアクセスの難しさのため、ゆっくりと進歩しています。アガードら。は、妊娠中に膣マイクロバイオームが在胎週数に基づいて変化し、ラクトバチルス種が病原性細菌の増殖を防ぐ役割を果たしていることを発見しました7。より具体的には、妊娠により膣微生物叢の多様性が減少し、乳酸桿菌の割合が増加し、安定性が高まります8,9。一部の膣内細菌は、子宮内の炎症や感染を介して早産に関連付けられています 10、11、12、13、14 が、これらの微生物叢を検査または監視するための臨床ガイドラインはありません。妊娠中のマイクロバイオームについて評価された他の部位は、母体 15、口腔 16、胎盤 5、羊水 17,18、新生児腸 19 です。しかし、これまでの研究は断片的であり、より体系的な研究が必要です。

この研究では、妊婦の膣分泌物 (VD) と羊水 (AF)、および新生児の臍帯血 (CB)、胃液 (GL)、および胎便 (M) 中のマイクロバイオームを包括的に特徴付けました。目標は、これらのサンプルとさまざまな産科状態との関係を判断することでした。

合計 141 人の低リスク妊婦が順次登録され、研究対象集団から 178 人の新生児が誕生し、そのうち 37 例が双胎妊娠でした。すべての女性はアジア系（韓国人）で、年齢中央値は 34 歳（四分位範囲 31 ～ 37）歳でした（表 1）。未婚率は人口の半分をわずかに超え (67%)、身長、体重、BMI の中央値はそれぞれ 162 cm、70 kg、27 kg/m2 でした。約30％は、子宮内授精（IUI）や胚移植を伴う体外受精（IVF-ET）などの生殖補助医療（ART）によって妊娠しました。前述のように、双胎妊娠は全人口の約 4 分の 1 であり、そのうち 19% は一絨毛膜妊娠でした。出産時の在胎週数の中央値は 37.7 週 (四分位範囲 36.9 ～ 38.6) で、在胎 37 週未満の早産は 26.2% (37/141) でした。帝王切開率は55％（77/141）でした。 7 人の新生児は先天性構造異常 (房室中隔欠損、脳梁欠損、軟骨無形成症、口唇裂、多指症、合指症) を持っていましたが、これらは新生児の生存に直接影響しませんでした。他の産科合併症または母体の基礎疾患の頻度を表 1 に示します。

子宮頸膣分泌物 (n = 154)、羊水 (n = 40)、胃液 (n = 100)、臍帯血 (n = 125) を含む 641 のサンプルから、19,597,239 個の細菌配列と 22,412 個の固有のアンプリコン配列変異体 (ASV) を特定しました。）、胎便（n = 160）、および陰性対照（n = 62）。 ASVには分類学的に注釈が付けられていましたが、VDを除くすべてのサンプルタイプのシーケンスデータにバッチ効果の証拠が見つかりました（図1および補足図S1）。バッチ効果は、シーケンシング自体ではなく、次世代シーケンシング（NGS）のライブラリ構築中に導入された可能性があります（補足図S2）。しかし、私たちのサンプルは低バイオマス検体を含む身体部位から収集されており、サンプルが汚染されやすいため、これは予想されていました20。したがって、補足図 S3 に概説されているように、多くの偽陽性が見つかると予想され、一連のフィルターを適用しました。特に、ネガティブコントロールで非常に蔓延していた（補足図S4）か、低濃度サンプルでより高い頻度を示した（補足図S5およびS6）ため、統計的に汚染物質として決定された203個のASVを見つけて削除しました。

16S rRNAアンプリコン配列決定データにおけるバッチ効果検出。中心対数比変換を使用して、相関係数に基づいて階層的にクラスター化されたヒートマップを生成する前に、フィルター処理された ASV テーブルを正規化しました。 AF、羊水。 CB、臍帯血。 GL、胃液。 M、胎便。 VD、子宮頸膣分泌物。 NC、ネガティブコントロール。

シャノン指数を計算することでサンプルのアルファ多様性を測定しました (図 2A)。アルファ多様性は、GL、AF、M、CB、VD の順に減少しました。ネガティブコントロールグループは、VD サンプルと比較してわずかに高い多様性を示し、16S アンプリコン配列決定のネガティブコントロールが実際の生物学的標本と同じくらい豊富な微生物叢の多様性を持つ可能性があることを示唆しています。次に、重み付けされた UniFrac 距離を計算することにより、サンプルのベータ多様性を推定しました (図 2B)。主座標分析 (PCoA) を使用して投影した場合、サンプルはサンプル収集サイトごとに適度に分離されていました。

韓国の母親と新生児のマイクロバイオームのアルファとベータの多様性。 (A) アルファ多様性: フィルタリングされた ASV テーブルは、各サンプルのシャノン指数が計算される前に細分化されました。 VD グループは、最も少ない量のアルファ多様性を示しました。 AF、羊水。 CB、臍帯血。 GL、胃液。 M、胎便。 VD、子宮頸膣分泌物。 NC、ネガティブコントロール。 (B) ベータ多様性: フィルタリングされた ASV テーブルは、サンプルが 2D 空間に投影される前に、重み付けされた UniFrac 距離を使用した主座標分析で強化されました。

母親が新生児と微生物を共有しているかどうかを判断するために、母親と新生児のペアと、異なる家族からランダムに選択した 1000 組のペアの間で共有されている ASV の平均数を比較しました。片側 t 検定を実施したところ、母親と新生児のペアは、ランダムに選択されたペアと比較して、共有 ASV の数が多いわけではないことがわかりました (それぞれ N = 0.7 対 N = 1.8; p = 1.0)。

サンプルのベータ多様性に見られる変動の原因をより深く理解するために、臨床情報を含むさまざまな要因を使用して順列多変量分散分析 (PERMANOVA) を実行しました。表 2 に示すように、すべてのサンプルタイプが分析に含まれている場合、変数「Site」は変動の 17.2% (p 値 = 0.001) を説明し、変数「LibraryMonth」は 7.4% (p 値 = 0.001) でした。 0.002）。この結果は、データセット内に大きなバッチ効果が存在するにもかかわらず、サンプルが体の部位に固有のマイクロバイオームパターンに基づいて依然として適切に分離できたことを示しています。分析がサンプル VD グループを除く各サンプルタイプに限定された場合、変数「LibraryMonth」はすべてのサンプルタイプに対して重要であることがわかりました。説明力は 24.5 ～ 48.9% の範囲に増加しました。これらの結果は、私たちのサンプルは主に低バイオマス標本であり、汚染されやすいという仮説と一致しています。

さらに、VD グループでは変数「deliveryMethod」が、M グループでは変数「PretermBirth37」と「AntibioticsUse」が、CB グループでは変数「Weight」が有意であるとして返されました (図 3)。重み付けされた UniFrac 距離を備えた PCoA を使用して、各グループの重要な変数を調査しました。 VD グループでは、いくつかの乳酸菌の ASV と 1 つのガードネレラの ASV が見つかりました。 M グループでは、ブドウ球菌が早産と強い関連性を示しました。最後に、細菌分類群のリストを CB グループの新生児の体重に関連付けました。表 3 は、複数のサンプルタイプにおける細菌との統計的に有意な関連性を研究するための、さまざまな臨床データのマイクロバイオーム構成分析 (ANCOM) を示しています。

PERMANOVA 分析のベータ多様性の結果。加重 UniFrac 距離を使用した主座標分析を、(A) 子宮頸膣分泌物サンプル、(B) および (C) 胎便サンプル、および (D) 臍帯血サンプルについて示します。

一絨毛膜と二絨毛膜の両方の双子からのサンプルは、ランダムに選択されたサンプルよりもマイクロバイオーム組成の類似性が高いという仮説を検証するために、双子のサンプルとランダムに選択されたサンプルの間の加重UniFrac距離の平均を比較しました。より具体的には、AF、CB、GL、および M グループのそれぞれについて、すべてのサンプルから置換を使用してペアごとの距離をランダムにサンプリングすることによりブートストラッピング仮説検定を 1000 回実行し、サンプリングされた距離の平均値で 95% の信頼区間を構築しました。双子サンプルの平均ペアワイズ距離が信頼区間を下回っていたため、4つのサンプルタイプすべてについて双子サンプルとランダムに選択されたサンプルの間に差がないという帰無仮説を棄却しました（図4および補足図S7）。次に、双子を一絨毛膜双生児と二絨毛膜双生児に分けて仮説検証を繰り返しました。二絨毛膜双生児の 4 つのサンプルタイプすべてについて帰無仮説を棄却できることがわかりました。一方、一絨毛膜双生児の場合は、CB グループと M グループのみがテストに合格しました。

ランダムに選択されたサンプルよりも、双子のサンプルの方がマイクロバイオーム組成の類似性が高い。サンプルの種類ごとに、双子サンプルの重み付けされた UniFrac 距離の平均が表示されます。 95% 信頼区間は、サンプルからの置換によるペアワイズ距離を 1000 回ランダムにサンプリングすることによって構築されました。

いくつかの病原性および共生膣微生物叢が、女性の生殖および全身の健康に重要な影響を与えることが示されています。一般に健康な妊婦における既知の臨床的関連性と膣微生物叢の参照範囲を確立するために、VD サンプル内の膣の健康を評価するために一般的に検査される細菌標的を検索しました。より具体的には、我々は、uBiome Inc. の「SmartJane」アッセイによって検査される、Lactobacillus、Sneathia、Gardnerella 21 を含む 31 の細菌標的 (15 属 16 種) に焦点を当てました。臨床的に重要な 31 種類の細菌分類群のうち、12 種類がサンプルで同定されました (図 5)。

膣の健康に関連する細菌の相対的な豊富さ。 uBiome の SmartJane アッセイでは、膣分泌物サンプルにも存在する細菌ターゲットのみが表示されています。

属レベルではラクトバチルス属の相対存在量が高いこと、エアロコッカス、フソバクテリウム、ガードネレラ、ペプトニフィルス、ポルフィロモナス、およびプレボテラの存在量が低いことを観察しました。私たちの患者のほとんどには、重篤な妊娠関連の合併症はありませんでした。さらに、早産の大部分は、34 + 0 週から 36 + 6 週までの後期早産期の範囲でした。したがって、「SmartJane」アッセイでは、病原性マイクロバイオームはほとんど捕捉されませんでした。仕様レベルが調査され、図 5 にリストされています。アッセイリストから Lactobacillus iners と Lactobacillus jensenii が見つかりましたが、Lactobacillus cristatus は膣のマイクロバイオームでは一般的に見つかりませんでした。これは単に、使用した SILVA 参照データベースが Lactobacillus Chrisatus を省略していたためである可能性があります。我々は、国立バイオテクノロジー情報センター（NCBI）データベースを使用して、ラクトバチルス属のASVの一部が実際にラクトバチルス・クリスパータスであることを確認した（データは示されていない）。

汚染はマイクロバイオーム研究において重要な問題であるため、私たちはいくつかの最新の方法を使用して細菌の存在を確認し、子宮内定着の証拠を発見しました。新生児が排出する最初の便である胎便中の独特の細菌組成は、正常な妊娠中の子宮内環境で微生物の定着が起こることを裏付けています 22,23。胎児は子宮内で羊水を飲み込み、正常な生理学的条件下では尿が羊水に戻ることから、予想通り、新生児の胃液中のマイクロバイオームは母体の羊水中のマイクロバイオームと類似していました。しかし、胃液中のマイクロバイオームは羊水中のマイクロバイオームとまったく同じではなく、胎児の口腔や食道などの近位消化管における子宮内環境からの細菌叢形成の未知のメカニズムが存在することを示しています。

この研究は、妊婦とその乳児のさまざまな体の部位からのサンプルが同様のマイクロバイオームを持っているかどうか、あるいは母親のマイクロバイオームが胎児に受け継がれるかどうかを判断することを目的としていました。私たちの結果は、マイクロバイオームは主に、母親と胎児のペアではなく、それが得られた体の区画に基づいて異なることを示唆しています。つまり、さまざまな産科状態を含むすべての要因のうち、サンプリング部位がマイクロバイオームの類似性を決定する最も重要な要因でした。

この研究の主な強みは、研究対象集団が純粋なアジア人で構成され、一般的な低リスクの妊娠を反映していることです。母親の年齢範囲は 20 歳から 45 歳の間であり、生殖年齢としては典型的であると考えられています。未産婦、帝王切開、男女の新生児の数はほぼ同数でした。低アプガースコアや胎便染色などの胎児仮死の少数の例を除いて、重度の早産や新生児集中治療室（NICU）での治療など、マイクロバイオームを変化させる可能性のある極度の病的状態にある新生児は除外された。。結果として、この研究集団で分析されたマイクロバイオームは典型的な妊娠を表す可能性があります。妊娠中のマイクロバイオーム構成をより深く理解するには、病理学的状態との比較の基礎として、低リスクの妊婦とその正常な新生児のマイクロバイオームライブラリーを確立することが重要です。

出産方法などの妊娠関連の症状に関連するマイクロバイオームを特定するために、存在量の差の統計分析を実施しました。微生物バイオマスの少なさ、および偽陽性結果をもたらす可能性がある研究対象の管理の難しさによってもたらされる課題にもかかわらず、表 3 にリストされている細菌は以前の発見と一致しているようです。たとえば、Finegoldia と Bifidobacterium は以前より健康な妊娠と関連付けられており、私たちのデータはこの関連性を裏付けています 24,25。表に記載されている他の分類群も、炎症や、妊娠糖尿病、子癇前症、早産などの妊娠合併症との関連性があります。たとえば、膣分泌物中のカンピロバクターおよびラクノスピラ科の存在は、これらの細菌感染が炎症や早産につながる可能性があることを示した以前の研究と一致しています26,27。

臨床データベースとの相互参照により、私たちの分析により、いくつかの重要な関連性が明らかになりました。まず、おりもの中にラクトバチルスとガードネレラが豊富に存在することは、妊娠中のマイクロバイオームのよく知られた指標です。乳酸菌は妊娠中の母体のマイクロバイオームで保護的な役割を果たしますが、ガードネレラは病原体とみなされ、早産や妊娠合併症と強く関連しています11、13、26。私たちの研究対象集団の症例数は比較的少なかったにもかかわらず、妊娠糖尿病ではフェカリバクテリウムが減少していることが示されているため、臍帯血中のフェカリバクテリウムの存在は注目に値します28。さらに、ブドウ球菌は胎便中の早産と強く関連していることが判明しました。この結果は、ブドウ球菌感染が早産につながる可能性があることを示唆する以前の研究結果と一致しています29,30。

抗生物質の影響については、抗生物質の使用と胎便サンプルとの関係を分析しましたが、サンプルサイズが小さいため、結果は限定的な関連性を示しました。 Tormo-Badia らのように。報告によると、抗生物質は妊娠中のマウスの子孫の腸内マイクロバイオームを変化させる可能性があります 31。妊娠中の「健康なマイクロバイオーム」の存在は、正常な妊娠を維持するために重要であると考えられているため、妊娠中の抗生物質投与による潜在的な悪影響は容易に想像できます。抗生物質は、感染や炎症、特定の疾患、または胎児への上行性感染のリスクを伴う早期破水の兆候がある妊婦にのみ投与されるため、胎児の状態の変化に対する抗生物質の効果を判断することは実際上困難です。出生関連のマイクロバイオーム。

胎便サンプルには、乳酸菌、ブドウ球菌、ウレアプラズマなどの微生物叢分類群の存在が示されており、これらは総称して膣内細菌叢として知られています 11,32。私たちは胎便の送達様式とマイクロバイオームとの関係を評価しようとしましたが、組成や多様性において統計的に有意な差は見つかりませんでした。 Dominguez-Bello らの研究によると、分娩方法に応じて乳児の腸内の細菌群集には違いがあります 33。経膣的に生まれた新生児は、母親の膣内微生物叢に似た微生物叢を有しており、乳酸菌が大半を占めています。逆に、帝王切開で生まれた乳児は、母親の皮膚表面によく見られるブドウ球菌、コリネバクテリウム、プロピオニバクテリウムが優勢なマイクロバイオームを持っています。

私たちの研究における妊娠の約 4 分の 1 は双胎妊娠 (37/141) でした。私たちの知る限り、これは双子の新生児のマイクロバイオームを評価した最初の研究です。一般に、私たちの双子のサンプル (AF、CB、GL、および M) は、別々の子宮内区画を持つ二絨毛膜双生児であっても、無作為に選択されたサンプルと比較して、より類似した組成を示しました。唯一の例外は一絨毛膜双生児からの CB サンプルと M サンプルで、ランダムに選択されたサンプルではより大きな類似性が示されました。これはおそらく一絨毛膜双生児のサンプルサイズが小さいためと考えられます。

妊娠に関連する微生物学的特徴を調査することは、長年にわたり困難で物議を醸す課題でした。羊水や胎盤などの胎腔への微生物の侵入は、早産や重篤な新生児の罹患率などの重篤な産科合併症を引き起こす可能性があり、これらは生涯にわたって持続する可能性があります。妊娠中のマイクロバイオームに関する研究の重要性にもかかわらず、倫理的およびアクセシビリティの問題により進歩は限られています。私たちは、標準化されたプロトコルを使用して妊婦とその新生児からさまざまなサンプルを収集し、他の妊娠関連または病理学的状態のサンプルを研究するための参照ライブラリとして機能するマイクロバイオームデータベースを確立しました。

前向き研究は、2020年3月から2021年1月の間に出産した出産を対象に実施された。サンプルは、ソウル大学盆唐病院で出産した女性とその新生児から収集された。バイタルサインが不安定な女性、輸血などの緊急管理が必要な女性、NICUに入院している新生児、または出生後にバイタルサインが不安定な女性は研究から除外された。マイクロバイオーム分析用のサンプルには、母体の VD、AF、CB、新生児の GL、および M が含まれていました。妊婦が出産を予定して入院したため、VD サンプルは、滅菌された器具の補助を受けながら、膣の後部円蓋に挿入されたポリエステル綿棒を使用して採取されました。鏡検査。分娩のための帝王切開、または特定の適応症（羊膜内の炎症/感染症の検出など）のための羊水穿刺を受けた患者については、研究のために注射器を介して約10ccのAFが採取されました。帝王切開と経膣分娩の両方の出産中、クランプ直後に臍帯の静脈からシリンジを通じて約 20 cc の CB が採取されました。注射針は、手術野の汚染を最小限に抑えるために、滅菌ドレープで囲まれた送達部位の臍帯に直接挿入されました。出生後に新生児の口や胃から羊水やその他の液体を除去するのは、気道を確保し自発呼吸を促すための初期管理の一環であるため、ほとんどの新生児は吸引処置を受け、液体は吸引ボトル（約 15 ml）に集められました。 GLの分析のためにコニカルチューブに移しました。新生児のごく初期の便である M サンプルは、新生児が初期管理後に安定したときに、肛門に挿入されたポリエステル綿棒を使用して生後 24 時間以内に慎重に採取されました。私たちは各女性と新生児から 5 つの異なるサンプルすべてを収集しようとしましたが、母親と新生児のペアからのサンプルのごく一部が臨床的状況により取得されなかったり、取り逃されたりしました。主な結果は、妊婦とその新生児から採取した上記サンプルのマイクロバイオームの分布と構成でした。さまざまな区画からのマイクロバイオームと産科因子との関連を判断するために、医療記録が収集され、徹底的に検討されました。データには、母親の年齢、分娩時の在胎週数、分娩方法（経膣分娩または帝王切開）、ARTの使用、その他の産科合併症、性別や出生体重などの新生児転帰が含まれます。

この研究は、ヘルシンキ宣言に従って、適切な参加者のインフォームドコンセントを得て実施されました。この研究プロトコールは、ソウル大学盆唐病院の治験審査委員会によって承認されました（B-1606/350-003）。

微生物のデオキシリボ核酸 (DNA) は、ZymoBIOMICS DNA Miniprep Kit (Zymo Research、カリフォルニア州アーバイン) を使用して VD、GL、AF、および CB サンプルから抽出され、DNeasy PowerSoil Pro Kit (Qiagen、メリーランド州ジャーマンタウン) を使用してサンプル M から抽出されました。メーカーの指示に従ってください。簡単に言うと、サンプルをビーズビーティングによって酵素的および機械的に溶解し、続いて付属のカラムで洗浄および濾過しました。抽出された DNA 濃度は、Qubit dsDNA HS アッセイキット (Thermo Fisher Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム) を使用して測定しました。抽出された DNA の総量は、VD では 1 ～ 10 μg、CB では 3 μg、M では 30 ～ 200 ng、GL および AF では 50 ng など、サンプルの種類に応じて変化しました。使用した DNA 抽出キットの各ボックスでは、ネガティブコントロールとして材料は使用されませんでした。ブランクはプロトコル全体で処理され、分析されました。

16S リボソームリボ核酸 (rRNA) 遺伝子は、16S メタゲノムシーケンシングライブラリーの調製 (Illumina、カリフォルニア州サンディエゴ) の 2 段階ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) プロトコールを使用して増幅されました。最初の PCR ステップでは、10 ng の各サンプル、10 μM の 341F/785R プライマー、および Herculase II 融合 DNA ポリメラーゼ (Agilent、カリフォルニア州サンタクララ) を使用して、16S rRNA 遺伝子の V3 ～ V4 超可変領域を増幅しました。以下のプライマー配列において、「N」塩基はランダムな塩基から選択され、「W」塩基は A または T、「H」塩基は A、C または T、「V」塩基は A、C、または G です。

341F: 5'- TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG-3'

785R: 5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC-3'

PCR サイクルは、95 °C で 3 分間の初期サイクルで実行され、その後、95 °C で 30 秒、55 °C で 30 秒、72 °C で 30 秒の 25 サイクル、および 72 °C での最終伸長サイクルで実行されました。 Cで5分間。アンプリコンは、AMPure XP ビーズ (Beckman Coulter、ブレア、カリフォルニア州、米国) で洗浄されました。 2 回目の PCR では、Nextera DNA CD Index Kit (Illumina、カリフォルニア州サンディエゴ) のインデックスプライマーを、1 回目の PCR で生成したアンプリコンの末端に追加しました。 PCR サイクルは、95 °C で 3 分間の初期サイクルで実行され、続いて 95 °C で 30 秒、55 °C で 30 秒、72 °C で 30 秒の 10 サイクル、および 72 °C での最終伸長サイクルで実行されました。 Cで5分間。各サンプルを AMPure XP ビーズ (Beckman Coulter、米国カリフォルニア州ブレア) で洗浄し、UltraPure DNase/RNase-Free Water (Thermo Fisher Scientific、マサチューセッツ州ウォルサム) で溶出しました。増幅された DNA は、Agilent DNA 1000 キット (Agilent、サンタクララ、カリフォルニア州、米国) を使用する 2100 Bioanalyzer システムを使用してチェックされました。各ライブラリー作製では、ネガティブコントロールとしてテンプレートを使用しませんでした。

DNA サイズと濃度に基づいて、アンプリコンを等モル量でプールし、30% PhiX (Illumina、San Diego、CA) を添加しました。次に、ペアエンド 250 サイクル MiSeq 試薬キット V2 (Illumina、カリフォルニア州サンディエゴ) および 300 サイクル MiSeq 試薬キット V3 (Illumina、カリフォルニア州サンディエゴ) を使用して、Illumina MiSeq プラットフォーム上でこれらを配列決定しました。 DNA 抽出およびライブラリーからのネガティブコントロールの配列を決定しました。

サンプルを9つのバッチ（実行1〜9）に分割し、Illumina MiSeqマシンを使用してサンプルあたり100,000のターゲット深さで16S rRNA遺伝子のV3-V4領域を配列決定しました（補足図S8）。最後のラン (ラン 9) を除くすべてのシーケンシングランでは、250 bp のペアエンドリードでシーケンシングを実行しました。最後のラン 9 では、実際的な理由から 300 bp のペアエンドリードでシーケンシングが行われました。各シーケンス実行の読み取り品質スコアを補足図S9に示します。 Illumina の bcf2fastq プログラムを使用して、生のシーケンスデータ (BCL ファイル) を逆多重化し、サンプルごとに順方向および逆方向の FASTQ ファイルを出力しました。注目すべきことに、一部のサンプルはバッチ効果の影響を評価するために複数回シーケンスされました。これらには、1 つのサンプルの同一の NGS ライブラリーを別々の実行でシーケンスする「シーケンス重複」と、同一サンプルから異なる日付で複数の NGS ライブラリーを調製し、個別にシーケンスする「ライブラリー重複」が含まれます。

特に明記されていない限り、すべての分析は、コミュニティが開発したマイクロバイオームバイオインフォマティクス用の強力なプラットフォームである QIIME 2 プラットフォームを使用して実行されました 34。シーケンス実行ごとに、FASTQ ファイルが QIIME 2 および DADA2 プラグイン 35 にインポートされ、シーケンスリードの低品質部分をトリミングし、トリミングされたリードのノイズを除去し、順方向リードと逆方向リードをマージすることによって ASV を識別しました（補足図 S8）。次に、個々のシーケンス実行で観察された ASV が 1 つの ASV テーブルにマージされました。潜在的な汚染物質を検出して除去するために、サンプルに対して除染プログラムを実行しました。このプログラムでは、低濃度サンプルでより高い頻度で出現し、ネガティブコントロールで繰り返し検出された ASV をシーケンスバッチごとに検索しました 36。分類分類は、SILVA データベースを使用した単純ベイズ分類器を使用して実行されました 37。 QIIME 2 からの出力を視覚化するために、QIIME 2 を使用したマイクロバイオーム配列解析用のオープンソースで MIT ライセンスの Python パッケージである Dokdo プログラム (https://github.com/sbslee/dokdo) を開発しました。Dokdo はこのアプリケーションを内部で使用します。 QIIME 2 のプログラミングインターフェイスなので、他の依存関係は必要ありません。 Dokdo を使用すると、さまざまな二次分析を実行したり、QIIME 2 ファイル/オブジェクトから出版品質の図 (分類学的棒グラフやアルファレアファクションプロットなど) を作成したりできます。

QIIME 2 コマンド「qiime Diversity core-metrics-phylogenetic」を使用して、サンプルのアルファおよびベータ多様性メトリクスを計算しました。コマンドを実行する際、サンプル間のリード深度の違いを正規化するために、「-p-sampling- Depth」オプションを使用してサンプルを 5,000 シーケンスリードに減らし、カバレッジの深さを同等にしました。また、希薄化曲線を作成することにより、すべてのサンプルが多様性分析に十分な範囲の深さまで配列されていることを確認しました（補足図S10）。さらに、「-i-phylogeny」オプションを使用して、観察された ASV の根付き系統樹を提供しました。これは、重み付けされた UniFrac 距離に基づいて PCoA を実行するために必要です38。

早産などの臨床情報に関連してマイクロバイオームの存在量の違いを評価するために、QIIME 2 コマンド「qiime Composition ancom」を使用して ANCOM を実行しました。より多くのサンプルグループ39。サンプルのグループがベータ多様性において互いに大きく異なるかどうかを判断するために、選択された変数を使用して線形モデルの仮定を距離行列（たとえば、重み付けされた UniFrac）に適合させる QIIME 2 コマンド「qiime多様性 adonis」を使用して PERMANOVA を実行しました。私たちは、scipy パッケージの「scipy.stats.t.interval」メソッドを使用して 95% 信頼区間を構築することでブートストラップ仮説検定を実行し、双子とランダムに選択されたサンプル間のマイクロバイオーム組成の類似性を比較しました40。

この研究から生成された配列決定データは、欧州ヌクレオチドアーカイブ (ENA) を通じてアクセッション番号 PRJEB52455 で INSDC データベースに寄託されました。 ENA の URL は https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/view/PRJEB52455 です。現在の研究中に生成されたデータは、合理的な書面による要求に応じて責任著者から入手できます。

羊水

マイクロバイオームの構成分析

生殖補助医療技術

アンプリコン配列変異体

ボディ・マス・インデックス

臍帯血

中心対数比

デオキシリボ核酸

胃液

子宮内授精

体外受精と胚移植

胎便

国立バイオテクノロジー情報センター

次世代シーケンス

新生児集中治療室

主座標分析

ポリメラーゼ連鎖反応

順列多変量分散分析

リボソームリボ核酸

子宮頸膣分泌物

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この研究は、ソウル大学盆唐病院研究基金 (14-2017-026) および中小企業・新興企業省のワールドクラス 300 プロジェクトの支援を受けました。

Jee Yuon Park と Huiyoung Yun の著者も同様に貢献しました。

韓国ソウル国立大学医科大学産婦人科

パク・ジユン＆パク・ジュンシン

韓国京畿道ソウル大学盆唐病院産婦人科

パク・ジユン＆キム・ヒョンジ

韓国ソウル国立大学医学部小児科

ジョン・ヨンファ＆チェ・チャンウォン

韓国京畿道ソウル大学盆唐病院小児科

ジョン・ヨンファ＆チェ・チャンウォン

韓国京畿道ソウル大学盆唐病院精密医療センター

ユン・ヒヨン、スンビン・リー、ジョンヨン・シン、ジョンソン・ソ

Macrogen Inc、韓国ソウル

ユン・ヒヨン、スンビン・リー、ジョンヨン・シン、ジョンソン・ソ

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Joong Shin Park または Jeong-Sun Seo への通信。

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Park、JY、Yun、H.、Lee、Sb. 他。母親、胎児、新生児のマイクロバイオームの包括的な特徴付けは、出生前における消化管の定着をサポートします。 Sci Rep 13、4652 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-31049-1

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受信日: 2022 年 4 月 22 日

受理日: 2023 年 3 月 6 日

公開日: 2023 年 3 月 21 日

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